Biologie clinique spécialisée

Le laboratoire BARLA réalise chaque jour plus de 1 000 dosages de biologie clinique spécialisée pour ses propres patients ou pour les patients d’autres laboratoires de France.

Cela concerne des analyses permettant de diagnostiquer des pathologies précises, d’affiner un diagnostic, de surveiller de près un traitement particulier. Elles sont moins fréquemment prescrites et elles nécessitent des équipements et des savoir-faire spécialisés.

Les laboratoires BARLA réalisent aussi des bilans biologiques demandés par les compagnies d’assurances, la médecine de santé au travail, ou pour des organismes de validation de protocoles thérapeutiques. Les prélèvements sont effectués à domicile ou indifféremment sur l’un des sites du laboratoire BARLA ou par un autre laboratoire ou établissement de santé « transmetteur ». Le traitement analytique a lieu au plateau technique du Centre de Biologie Médicale Saint-Roch de Nice.

Le pôle de Biologie clinique spécialisée en détails

Techniques immuno-enzymologiques

Le principe des techniques immuno-enzymologiques

Grâce au principe universel d’affinité entre un antigène et ses anticorps spécifiques, les biotechnologies savent créer,  de nombreux réactifs reconnaissant individuellement différentes molécules qui peuvent circuler dans l’organisme humain. Ce principe est utilisé en deux étapes :

  • lors de la fabrication du réactif, la molécule concernée (antigène) est mise en contact avec des cellules productrices d’anticorps, vivant en culture et issues de banques cellulaires. L’anticorps est produit en grande quantité dans des bioréacteurs, puis purifié et couplé à des supports (microparticules) ou des réactifs révélateurs qui permettront la mesure par des analyseurs.
  • Ensuite au laboratoire de biologie, lors de la réalisation de l’analyse, l’anticorps spécifique contenu dans le réactif va rencontrer l' »antigène » contre lequel il est dirigé (la molécule à doser, contenue dans l’échantillon biologique du patient). Naturellement, ils vont se lier l’un à l’autre grâce à leur affinités. Le reste du réactif non « lié » est ignoré par le système de mesure qui ne révèle et quantifie que la partie qui a réagi.

Lorsque le phénomène de révélation utilise des enzymes on parle d’immuno-enzymologie. Ce principe réactionnel concerne plus de 80% des analyses couramment utilisées en biologie médicale puisqu’on peut l’appliquer à presque toutes les molécules naturellement présentes dans l’organisme humain, mais aussi envers des molécules qui lui sont apporté de l’extérieur (extrinsèques), telles que les médicaments et les drogues.

Les dosages hormonologiques (suivi biologique de la fertilité, de la ménopause, de l’andropause, des surrénales et de la thyroïde), les dosages sérologiques (mesure des anticorps circulants dans le sérum en réponse à des agents infectieux), des marqueurs tumoraux (protéines présentes ou augmentées en cas de cancers), des marqueurs de l’anémie (protéines impliquées dans le transport du fer), des marqueurs cardiaques (témoin d’une souffrance du muscle cardiaque ou de l’imminence d’un infarctus) sont réalisés sur un trio d’analyseurs DXI de Beckman.

En renfort, d’autres automates complètent la gamme d’immuno-enzymologie

Les dosages des anticorps sériques de la rubéole, EBV, CMV sont réalisés sur un Bioplex 2200 de Bio-Rad. Le module Liaison XL Dia-Sorin permet de doser les anticorps de la syphillis (TPHA), le peptide C, l’ACTH, la calcitonine et des marqueurs osseux (vit D, PTH),le dosages de la delta-4 androsténedione . Cet analyseur réalise aussi une large gamme de dosages sérologiques, le virus de l’herpes, les chlamydiae génitaux, la varicelle et le zona, le mycoplasme pneumoniae et les bactéries impliquées dans la maladie de Lyme. L’analyseur Allegria réalise le dosage sérologique des Chlamydiae respiratoires. L’Immulite de Siemens réalise la cotinine,  la gastrine, l’homocystéine, les récepteurs de l’interleukine 2, la SHG, la somatomédine et la sérologie de d’Helicobacter pilori. Le Cobas E411 permet le dosage des anticorps antirécepteurs de la TSH, les cross-laps, la cyclosporine, la somatomédine, le tacrolimus et les marqueurs de tumeur CYFRA 2 et NSE.

Comment fonctionnent ces analyseurs ?

Les échantillons pour les autres appareils d’immuno-enzymologie sont dispatchés par un trieur, qui les conditionne sur des portoirs pour être chargés à bord des analyseurs concernés. Grâce à la lecture des étiquettes code à barre placés sur les tubes dès le prélèvement, le système sait vers quel automates les acheminer et les appareils savent quels sont les dosages à réaliser. A tout moment le système peut être interrogé pour localiser un échantillon et connaître son statut en temps réel.

L’immuno-hématologie : analyses liées aux groupes sanguins

A quoi sert de connaitre son groupe sanguin, son rhésus ou la présence d’agglutines irrégulières  ?

La réalisation du groupe sanguin permet en médecine de garantir la sécurité transfusionnelle et la comptabilité materno-foetale. Elle consiste en la détermination des systèmes ABO et Rhésus/Kell. Le système ABO permet de déterminer quatre groupes sanguins : A, B, AB et O. La particularité du système ABO est que chaque individu synthétise des anticorps dirigés contre les antigènes de surface qui n’existent pas dans son propre sang. Ainsi, les personnes du groupe A, présentent des anticorps anti-B, ceux du groupe B, des anticorps anti-A, les porteurs du groupe O forment des anticorps anti A et anti B. Les porteurs du groupe AB ne forment aucun anticorps.

D’autres systèmes interviennent aussi, comme ceux du Rhésus. L’antigène Rhésus D (RH1) est présent chez 85% des personnes en France et il est systématiquement recherché lors d’un groupe sanguin.Nous comprenons que si nous devons être transfusé, il est vital qu’un groupe sanguin compatible avec le notre soit utilisé. Nous comprenons aussi que la mère et son bébé peuvent rencontrer des problèmes si leurs groupes sanguins sont différents et si la mère a des anticorps  qui réagissent avec des antigènes présents à la surface des globules rouges de son bébé. Par exemple, si elle présente un Rhésus D négatif avec une recherche d’agglutines irrégulières (RAI) positive mettant en évidence des Ac anti RHD immuns et qu’elle est enceinte d’un bébé Rhésus D positif, il y a un risque pour le bébé d’anémie hémolytique.

 

Les technologies utilisées au laboratoire BARLA pour les groupes sanguins et la RAI

La détermination des groupes sanguins et Rhésus/Kell et la recherche des agglutinines irrégulières (RAI) sont réalisées sur un duo de systèmes IH 1000 BIO-RAD Diamed utilisant la technologie standard ID-système de carte de gel. Les résultats sont transmis à l’EFS (Établissement français du sang) par protocole ERA (Envoi des résultats d’analyses) crypté et qui garantit la sécurisation du transfert des données servant à une transfusion sanguine en évitant tout risque d’erreur lié à une transcription manuelle. C’est pour cela que l’identification des tubes par des étiquettes codes à barre est obligatoire et que des vérifications de l’identité du patient sont réalisées par double saisie à la création de son dossier, s’il contient une analyse concernée.

 L’auto-immunité

Quand parle-t-on d’auto-immunité ?

Normalement, le système immunitaire identifie que les tissus de l’organisme (le « soi ») ne sont pas des substances « étrangères » (le « non-soi ») et ne les attaque pas. Mais pour certains, l’organisme produit des anticorps dirigés contre ses propres tissus, comme cela se voit dans des maladies auto-immunes ou lors de réactions d’hypersensibilité. La cause des maladies auto-immunes est inconnue, mais il s’avère qu’il y a fréquemment une prédisposition génétique à leur développement. Parfois elles font suite à une infection bactérienne ou virale. Elles peuvent atteindre plusieurs organes (systémiques), ou seulement un organe ou un tissu (spécifiques d’organe).

Les technologies d’auto-immunité au laboratoire BARLA

Pour le dosage des auto-anticorps le laboratoire BARLA utilise l’immunofluorescence indirecte, technique de référence, pour rechercher une vingtaine d’auto-anticorps différents. La préparation des lames et la lecture par screening est totalement automatisée sur un AFT 3000 Image Navigator d’Eurobio équipé d’un microscope Nikon robotisé. Le système est directement connecté au SIL pour une sécurité et traçabilité totale. Quant à l’automate Bioplex 2200 il réalise la recherche d’anti-DNA, anti-ENA solubles, anti-tTG, et anti-gliadine (maladie coeliaque) et anti-CCP grâce à des billes magnétiques coatées avec différents « ligands » reconnaissant ces différents auto-anticorps de manière simultanée grâce à la détection « multiplex ». En complément l’analyseur Allegria réalise le dosage des auto-anticorps anti-cardiolipine et anti-beta2-GP1. D’autres auto-anticorps ne peuvent pas être détectés par ces techniques mais nécessitent l’utilisation d’un immunodot spécifique : Ac anti – hépatopathies, anti-pm-Scl, anti-myopathies.

La biologie moléculaire

Quel est l’intérêt de la biologie moléculaire en médecine humaine ?

La biologie moléculaire est une discipline de pointe qui permet de repérer des fragments d’ADN  (acides désoxyribonucléiques) ou d’ARN (acides ribonucléiques) qui sont les molécules du génome. Au laboratoire BARLA, nous l’utilisons pour rechercher l’ADN ou l’ARN de certains agents infectieux précis (bactéries ou virus) dans le sang du patient ou dans d’autres types de prélèvements biologiques (comme l’urine et les prélèvements génitaux).

L’analyse se réalise en deux temps, l’ « extraction » des acides nucléiques contenus dans le prélèvement puis leur « amplification » qui elle même peut être réalisée selon deux techniques :

  • la réaction en chaîne par polymérase (PCR en anglais, pour Polymerase Chain Reaction) qui permet de faire en un temps record des millions de copies d’une séquence précise (amplification) d’ADN
  • ou la PCR à transcription inversée (RT-PCR en anglais pour Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) pour l’amplification de l’ARN.

Nous comprenons donc qu’une toute petite quantité initiale de l’agent infectieux peut être repérée dans un échantillon biologique, sans équivoque sur son identification. Depuis peu, les techniques de PCR en temps réel (qPCR) permettent des mesures quantitatives des molécules d’ADN et d’ARN.

Ces tests permettent la mise en évidence d’agents infectieux dont la mise en culture est difficile, voire impossible en bactériologie ou virologie classique. Ils complètent les tests sérologiques (dosage des anticorps) qui renseignent sur la réaction immunitaire face à un agent infectieux mais qui souvent ne permettent pas de dépister des infections débutantes, de différencier les infections actives de celles gardées en mémoire ou de celles qui restent muettes.

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Les technologies de biologie moléculaire utilisées au laboratoire BARLA

Le laboratoire BARLA utilise la technologie de PCR en temps réel sur Cobas 4800 Roche. L’extraction des ADN et ARN est réalisée sur 2 automates X480 qui garantissent une sécurité accrue des résultats en éliminant les risques de contamination croisée. Les ADN ou ARN extraits sont alors traités sur des analyseurs Z480 destinés à l’amplification et la détection des différents agents infectieux recherchés.

Les tests de biologie moléculaire du laboratoire BARLA explorent quelles maladies ?

Nous recherchons et quantifions l’ARN du virus de l’hépatite C et l’ARN du VIH ainsi que l’ADN du virus de l’hépatite B  afin de suivre l’efficacité du traitement. Nous recherchons l’ADN des Chlamydiae trachomatis lors du dépistage de cette maladie sexuellement transmissible, qui est souvent asymptomatique durant de longues années,  pouvant provoquer des stérilités féminines lorsqu’elle n’est pas prise en charge à temps. Nous pouvons également mettre en évidence l’ADN Neisseria gonorrhoeae, l’herpes simplex virus 1 et 2  et de Mycoplasma genitalium , autres agents d’IST. Ces bactéries sont difficiles à mettre en évidence par culture microbiologique car les germes fragiles périssent vite hors de l’organisme qu’ils ont infecté. Nous recherchons l’ADN de Bordetella pertussis et Bordetella parapertussis responsables de la coqueluche, maladie respiratoire très contagieuse et qui peut être grave chez le nourrisson et les personnes fragiles.

Cytométrie de flux

Quelles sont les caractéristiques de la cytométrie de flux ?

La cytométrie de flux analyse les cellules du système immunitaire : les lymphocytes (sous population des globules blancs) pour établir le typage lymphocytaire. Les lymphocytes sont observées à l’état vivant, afin de les dénombrer et les répartir en différentes sous populations. Elles sont différenciées entre elles selon des critères de taille, de forme et de complexité structurelle. On utilise des réactifs fluorescents spécifiques d’un site précis de la membrane cellulaire. Le compte et la répartition des sous-populations lymphocytaires sont utilisés pour suivre des infections comme le VIH, la maladie de Lyme ou l’évolution de certaines maladies auto-immunes. Dans le cas d’autres maladies chroniques, le typage lymphocytaire sert à mesurer l’agressivité de l’atteinte et le comportement de notre système immunitaire.

Les technologies de cytométrie utilisées au laboratoire BARLA

Un duo de FC500 Beckman réalise la cytométrie : les cellules en suspension passent une à une devant plusieurs faisceaux laser et des détecteurs captent les signaux émis par chaque cellule. Le principal avantage de la cytométrie en flux est la vitesse d’acquisition des données pour un très grand nombre de cellules, comparées et analysées, par un logiciel informatique « intelligent » permettant l’analyse de sous-populations cellulaires complexes et/ou rares impliquées dans la réponse immunitaire.

Les techniques d’immuno-blot

Quelles sont les spécificités des techniques immunoblot ou western-blot ?

Pour certaines maladies, elles donnent plus de précision que les autres techniques sur les différents antigènes de l’agent infectieux qui ont donné lieu à la fabrication d’anticorps dans l’organisme du patient. On parle de mémoire spécifique. Ces tests permettent aussi de déterminer la classe du virus ou l’espèce précise de la bactérie impliqués, et selon les cas, le stade de l’infection. Il s’agit d’une technique immuno-chromatographique sur bandelette de nitrocellulose le long de laquelle sont présents différents antigènes de l’agent infectieux, rangés selon leur poids moléculaire. Lors de l’analyse, si le sérum du patient contient les anticorps dirigés contre ces antigènes, ils s’accrochent sur les antigènes fixés sur la bandelette. Un réactif enzymatique colore ces zones, permettant ainsi de dresser l’inventaire des anticorps et de les estimer de façon semi-quantitative.

Les technologies immuno-blot ou western-blot  utilisées au laboratoire BARLA :

L’immunoblot VIH est réalisé sur Geenius de Biorad. Ce test est nécessaire pour la confirmation de la présence des anticorps anti VIH-1 et VIH-2. L’Autoblot de Biosynex-Alldiag permet la détection d’anticorps circulants dans le sang lors de la maladie de Lyme : les IgG et des IgM spécifiques des 5 espèces de Borrelia : B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii, B. spielmanii et B. bavariensis.

Dosage des allergènes

Comment déterminer une allergie par des analyses sanguines ?

L’allergie est une hypersensibilité spécifique envers des substances étrangères à l’organisme qui ne causent pas de réaction chez la plupart des sujets. Cette hypersensibilité provoque une réaction immunologique qui produit des anticorps (appelés IgE) et spécifiques pour chaque type d’allergène. Nous ne sommes pas tous égaux face à ce type de réaction. L’allergie peut être alimentaire, respiratoire ou de contact. Ces IgE peuvent êtres dosées grâce à des réactifs qui les reconnaissent de manière individuelle (IgE spécifiques) ou groupée (mélange d’allergènes les plus communs respiratoires Phadiatop ou alimentaires Trophatop).

Les technologies utilisées au laboratoire BARLA pour doser les allergènes

Les allergènes sont analysés sur un ImmunoCAP 250 de Phadia qui dose une soixantaine d’IgE spécifiques des différents pollens, moisissures, aliments et latex et les mélanges trophatop et phadiatop.